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《二师兄聊磁珠2》之磁珠法核酸纯化那点事儿12、全血基因组提取时为何会出现260:230比值偏低的情况?

发布日期:2018-11-29信息来源: 《二师兄聊磁珠2》磁珠法核酸纯化那点事儿篇章点击率:

12、全血基因组提取时为何会出现260:230比值偏低的情况?

二师兄聊磁珠2

情况分析

1、样本本身,这个是最主要因素 ; 

2、裂解不充分;

3、清洗不充分。

在三个因素里面,清洗不充分是最小的影响因素,通常磁珠吸附DNA之后,吸附的盐分比较少,逐步清洗后会稀释更少了。剩下的两个因素,血液样本本身的问题是真正的主要原因,但是样本没得选,因此只能在裂解步骤找办法。

情况0501X.jpg分析

大家要知道一个样本260:280还不错,有几种情况会导致260:230偏低:

第一种,蛋白酶K活性下降,导致260:230偏低。

第二种,血样的体积选择不合适。

第三种,就是裂解的过程中裂解或者振荡不充分,我们会针对这三种情况分别阐述。

磁珠法核酸提取那点事儿
试剂盒1.jpg

因为蛋白酶K放在冰箱里面经常会拿进拿出,实验员往往也会用完后忘在桌上一两个小时后才记得放回冰箱,或者很长时间后偷偷放回冰箱,这种情况经常遇到,大家一定要注意这点。

取样误差


第二种情况,有时候我们为了得到较高浓度的核酸,往往会增加样本体积。最后浓度反而没增加,260:230比值下降,或者浓度有增加,但是跑胶时,主条带并没有变得更亮,也就是说,浓度虚高。因此请注意不要刻意增加血液体积,以图得到更多核酸。甚至于可以稍减少样本体积,从200uL降到180uL,下降一点点样本量,反而更容易得到更好的数据。
裂解不充分(裂解、振荡时间不足)

再有一个,振荡不充分,也会导致比值下降。如果出现260:230比值偏低,我们在排除蛋白酶K活性因素,上样量是否偏大,如果说我们取样量由200uL不小心加至250uL,那么我们的260:230比值必定偏低。第二个裂解时间是否充足、裂解过程中是否充分振荡。若我们实验时间较为充裕,建议大家可适当延长裂解时间(适当延长10~20min),如此操作可规避取样误差引起的纯度降低现象。同时在裂解期间建议可采用振荡仪适当振荡混匀样品。若选用英芮诚的96孔板加热振荡仪:动态加热裂解,可大幅度提高工作效率。因为动态加热裂解的效果会较传统的水浴锅裂解好很多。

总  结

清洗不充分(影响力度较小);

取样误差问题,建议采用200uL吸头取样;

蛋白酶k活性降低,260:230比值低,核酸浓度高低不均一; 

样品本身问题。  

振荡时间不足,导致裂解不充分。

建议采用英芮诚96孔板加热振荡仪,动态加热裂解。



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